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CUT&RUN

Lernen Sie CUT&RUN kennen – eine Alternative für ChIP-qPCR und ChIP-seq zur Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen im Chromatin die nur geringe Zellanzahlen benötigt.

Was ist CUT&RUN?

Die Entwicklung von Methoden wie der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und der ChIP-seq, die die Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglichen, hat zu einem wachsenden Bewusstsein dafür geführt, dass Störungen in der epigenetischen Regulation eine breite Vielfalt an menschlichen Erkrankungen auslösen. Cleavage Under Target & Release Using Nuclease (CUT&RUN) ist eine neue Technologie, die für das Chromatin-Profiling angewendet werden kann.

Wie sie funktioniert

CUT&RUN ist eine in-vivo-Methode. Sie nutzt einen Zielantigen-spezifischen primären Antikörper und eine Protein A-Protein G-Micrococcal Nuclease (pAG-MNase), um gezielt bestimmte Protein-DNA-Komplexe zu isolieren1,2,3. Von der Zelle zur DNA benötigt diese Methode nur 1 bis 2 Tage – und für maximalen Durchsatz und maximale Reproduzierbarkeit kann sie automatisiert werden4.

CUT&RUN Diagramm

Um den Protein-DNA-Komplex von Interesse zu isolieren, werden die Zellen zuerst geerntet und an Concanavalin A-beschichtete Magnetpartikel gebunden. Dadurch wird die Handhabung der Zellen vereinfacht und der Verlust von Zellen während der nachfolgenden Waschschritte minimiert. Zellmembranen werden mit Digitonin permeabilisiert, um dem primären Antikörpers den Zugang zum Zellkern zu ermöglichen. Dort bindet er an das Histon, den Transkriptionsfaktor oder den Kofaktor von Interesse. Dann bindet die pAG-Domäne des pAG-MNase-Fusionsproteins an die schwere Kette des primären Antikörpers und steuert das Enzym so zielgerichtet zu der Chromatinregion von Interesse. Durch die Zugabe von Ca2+ wird die pAG-MNase aktiviert und der DNA-Verdau beginnt. Dies ermöglicht es den gespaltenen Chromatinkomplexen, vom genomischen Chromatin weg, aus dem Zellkern heraus und in den Probenüberstand zu diffundieren. Aus diesem können sie entweder mit einer DNA-Spinsäule oder durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolpräzipitation gewonnen werden.

Die aufgereinigte und angereicherte DNA kann dann mittels qPCR identifiziert und quantifiziert werden. Oder sie wird zum Erzeugen einer DNA-Sequenzbibliothek verwendet, die für das Next-Generation-Sequencing (NGS) oder die Kartierung des gesamten Genoms (Whole-Genome Mapping) eingesetzt wird.

Vorteile von CUT&RUN

Cell Signaling Technology® (CST) bietet einen CUT&RUN-Assay an, der viele der Herausforderungen überwindet, die andere Techniken des Whole-Genome Mapping mit sich bringen. Das CUT&RUN Assay Kit von CST bietet folgende Vorteile:

Benötigt nur geringe Probenmengen Nur 100.000 Zellen sind erforderlich
Schnelle Ergebnisse 1 bis 2 Tage von der Zelle zur DNA
Kosteneinsparung bei der Sequenzierung Nur 3 bis 5 Millionen qualitativ hochwertige Lesevorgänge notwendig
Vielseitig in Bezug auf Zielantigene Erzeugen Sie Sequenz- und/oder qPCR-Daten für Histone, Histonmodifikationen, Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren
Vielseitig in Bezug auf Antikörper Mit Kaninchen- und Maus-Antikörpern kompatibel
Reproduzierbare Ergebnisse Geben Sie Kontroll-DNA hinzu („Spike-in“), um Signale zwischen Proben zu normalisieren
Vermeiden Sie „Quervernetzungs“-Artefakte Eine in-vivo-Methode, die mit nativem Chromatin durchgeführt wird

 

Nur geringe Probenmengen erforderlich

Sparen Sie Zeit – indem Sie nur 100.000 Zellen kultivieren – zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen und/oder um epigenetische Informationen aus nur gering vorkommenden Zelltypen zu erhalten.

CUT&RUN-Ergebnisse mit abnehmenden Zellzahlen

Vergleichbare Ergebnisse wurden erhalten, wenn abnehmende Zahlen an HCT 116-Zellen zur Durchführung des CUT&RUN-Assays mit dem CUT&RUN Assay Kit #86652 eingesetzt wurden. Die Assays wurden entweder mit dem Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (linkes Panel) oder dem Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 (rechtes Panel) durchgeführt. Die angereicherte DNA wurde mittels Real-time-PCR und unter Verwendung des SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 und der SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516, SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653, SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669 und SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 quantifiziert. Die Menge der immunpräzipitierten DNA in jeder Probe ist als Signal relativ zur Gesamtmenge des eingesetzten Chromatins (Prozent Einsatzmenge für 100.000 Zellen) dargestellt. Die Daten wurden mittels „Spike-in“-DNA normalisiert, die zu jeder Reaktion hinzugegeben wurde.

Schnelle Ergebnisse

Sparen Sie an der Zeit, die die Anreicherung des Zielchromatins benötigt. Investieren Sie nur 1 bis 2 Tage, um von den Zellen zur DNA zu gelangen.

Kosteneinsparung bei der Sequenzierung

Durch den relativ geringen Hintergrund können Sie Ihre Signale schon bei geringeren Sequenzierungstiefen vom genomischen Hintergrund unterscheiden. Sequenzdaten können schon mit nur 3 bis 5 Millionen qualitativ hochwertigen Lesedurchgängen erhalten werden und Ihre Sequenzierungskosten werden so wesentlich verringert. Ein zusätzlicher Bonus? Der geringe Hintergrund dieser Methode ermöglicht es außerdem, Profile von genomischen Eigenschaften mit geringen Signalen zu erzeugen.

Vielseitig in Bezug auf Zielantigene

Aufgereinigte, angereicherte DNA kann für die Erforschung von Histonen, Histonmodifikationen, Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren in Sequenzier- und/oder qPCR-Experimenten eingesetzt werden.

Histonmodifikationen

Der CUT&RUN Assay Kit #86652 funktioniert für die Erforschung von Histonmodifikationen genauso gut wie ChIP-qPCR und ChIP-seq – und nur 100.000 Zellen werden benötigt.

H3K4me3-qPCR-Ergebnisse für CUT&RUN und ChIP

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HCT 116-Zellen (1x105 Zellen für CUT&RUN, 4x106 Zellen für ChIP) und dem Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 oder der Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 durchgeführt. Verwendet wurde der CUT&RUN Assay Kit #86652 (linkes Panel) oder der SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 (rechtes Panel). Die angereicherte DNA wurde mittels Real-Time-PCR unter Verwendung des SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 und der SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516 und der SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 quantifiziert. Die Menge der immunpräzipitierten DNA in jeder Probe ist als das Signal relativ zur Gesamtmenge des Input-Chromatins dargestellt, die dem Wert 1 entspricht.

H3K4me3-Sequenzierungs-Ergebnisse für CUT&RUN und ChIP

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HCT 116-Zellen (1x105 Zellen für CUT&RUN, 4x106 Zellen für ChIP) und dem Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 durchgeführt. Verwendet wurde der CUT&RUN Assay Kit #86652 oder der SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005. Die DNA-Bibliotheken wurden mit dem SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 generiert. Panel A vergleicht die Anreicherung von H3K4me3 entlang Chromosom 12, während Panel B die Anreicherung am GAPDH-Gen, einem bekannten Zielgen von H3K4me3, vergleicht. Die Input-Spuren stammen von der CUT&RUN Input-Probe.

Transkriptionsfaktoren

Der CUT&RUN Assay Kit #86652 funktioniert für die Erforschung der DNA-Protein-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren genauso gut wie ChIP-qPCR und ChIP-seq – und nur 100.000 Zellen werden benötigt.

CTCF-qPCR-Ergebnisse für CUT&RUN und ChIP

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HCT 116-Zellen (1x105 Zellen für CUT&RUN, 4x106 Zellen für ChIP) und dem CTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418 oder der Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 durchgeführt. Verwendet wurde der CUT&RUN Assay Kit #86652 (linkes Panel) oder der SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 (rechtes Panel). Die angereicherte DNA wurde mittels Real-Time-PCR unter Verwendung des SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 und den humanen c-Myc-Promoter-Primern, den SimpleChIP® Human H19/Igf2 ICR Primers #5172 und den SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 quantifiziert. Die Menge der immunpräzipitierten DNA in jeder Probe ist als das Signal relativ zur Gesamtmenge des Input-Chromatins dargestellt, die dem Wert 1 entspricht.

CTCF-Sequenzierungs-Ergebnisse für CUT&RUN und ChIP

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HCT 116-Zellen (1x105 Zellen für CUT&RUN, 4x106 Zellen für ChIP) und dem CTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418 durchgeführt. Verwendet wurde der CUT&RUN Assay Kit #86652 oder der SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005. Die DNA-Bibliotheken wurden mit dem SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 generiert. Panel A vergleicht die Anreicherung von CTFC entlang Chromosom 8, während Panel B die Anreicherung am MYC-Gen, einem bekannten Zielgen von CTCF, vergleicht. Die Input-Spuren stammen von der CUT&RUN Input-Probe.

Kofaktoren

Der CUT&RUN Assay Kit #86652 funktioniert für die Erforschung der DNA-Protein-Wechselwirkungen von Kofaktoren genauso gut wie ChIP-qPCR und ChIP-seq – und nur 100.000 Zellen werden benötigt.

Rpb1-CTD-qPCR-Ergebnisse für CUT&RUN und ChIP

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HeLa-Zellen (1x105 Zellen für CUT&RUN, 4x106 Zellen für ChIP) und dem Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 oder der Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 durchgeführt. Verwendet wurde der CUT&RUN Assay Kit #86652 (linkes Panel) oder der SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 (rechtes Panel). Die angereicherte DNA wurde mittels Real-Time-PCR unter Verwendung des SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 und der SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014, SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516 und SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 quantifiziert. Die Menge der immunpräzipitierten DNA in jeder Probe ist als das Signal relativ zur Gesamtmenge des Input-Chromatins dargestellt, die dem Wert 1 entspricht.

Rpb1-CTD-Sequenzierungsergebnisse für CUT&RUN und ChIP

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HeLa-Zellen (1x105 Zellen für CUT&RUN, 4x106 Zellen für ChIP) und dem Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 unter Verwendung des CUT&RUN Assay Kit #86652 durchgeführt. Die DNA-Bibliotheken wurden mit dem SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 generiert. Panel A vergleicht die Anreicherung von Rpb1 entlang Chromosom 12, während Panel B die Anreicherung am GAPDH-Gen, einem bekannten Zielgen von Rpb1, vergleicht. Die Input-Spuren stammen von der CUT&RUN Input-Probe.

Vielseitige Antikörperkompatibilität

Die pAG-MNase bindet sowohl Maus- als auch Kaninchen-Antikörper und vergrößert so das Spektrum an Antikörpern, die mit CUT&RUN-Assays kompatibel sind.

Kaninchen-Antikörper

CUT&RUN ist mit Kaninchen-Antikörpern kompatibel

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HeLa-Zellen und dem Acetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) XP® Rabbit mAb #8173 unter Verwendung des CUT&RUN Assay Kit #86652 durchgeführt. Die DNA-Bibliotheken wurden mit dem SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 generiert. Panel A vergleicht die Anreicherung von H3K27Ac entlang Chromosom 12, während Panel B die Anreicherung am GAPDH-Gen, einem bekannten Zielgen von H3K27Ac, vergleicht.

Maus-Antikörper

CUT&RUN ist mit Maus-Antikörpern kompatibel

Die CUT&RUN- und ChIP-Assays wurden mit HeLa-Zellen und dem Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 unter Verwendung des CUT&RUN Assay Kit #86652 durchgeführt. Die DNA-Bibliotheken wurden mit dem SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 generiert. Panel A vergleicht die Anreicherung von Rpb1 entlang Chromosom 12, während Panel B die Anreicherung am GAPDH-Gen, einem bekannten Zielgen von Rpb1, vergleicht.

Reproduzierbare Ergebnisse

Fügen Sie heterologe DNA hinzu (Spike-in), um Ihre Daten zu normalisieren und Ihre experimentelle Reproduzierbarkeit zu verbessern. Normalisieren Sie Proben innerhalb eines Experiments oder verschiedener Experimente.

Signale des CUT&RUN-Assays können mit Spike-in-DNA normalisiert werden

Normalisierung von CUT&RUN-Assaysignalen durch Verwendung von Spike-in-DNA in einer qPCR-Analyse. Die CUT&RUN-Assays wurden unter Verwendung des CUT&RUN Assay Kit #86652 mit HCT 116-Zellen in abnehmender Anzahl und entweder mit dem Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (obere Panels) oder dem Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 (untere Panels) durchgeführt. Die angereicherte DNA wurde mittels Real-time-PCR und unter Verwendung des SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 und der SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516, SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653, SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669 und SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 quantifiziert. Die Menge der immunpräzipitierten DNA in jeder Probe ist als Signal relativ zur Gesamtmenge des eingesetzten Chromatins (Prozent Einsatzmenge für 100.000 Zellen) dargestellt. Nicht-normalisierte Anreicherungen sind in den linken Panels dargestellt. Die Spike-in-DNA zur Probennormalisierung wurde jeder Reaktion proportional zur Anfangszellzahl hinzugefügt. Basierend auf den Unterschieden der qPCR-Signale der Spike-in-DNA in jeder Probe, wurden die CUT&RUN-Signale auf die Probe normalisiert, die 100.000 Zellen beinhaltet. Normalisierte Anreicherungen sind in den rechten Panels dargestellt.

Vermeiden Sie „Quervernetzungs-Artefakte“

CUT&RUN funktioniert mit nativem Chromatin und erfordert keine Quervernetzung oder Immunpräzipitation, die zu „Quervernetzungs-Artefakten“ führen könnte.

Produktangebote

CST bietet flexible Lösungen für Ihre CUT&RUN-Assays – ob Sie gerade die Epigenetik in Ihrer Forschung neu erkunden oder schon Experte sind. Das Einzige, was Sie selbst bereitstellen müssen, ist ein primärer Antikörper gegen Ihr Protein von Interesse. CST liefert alles andere in einem ganz einfach zu bestellenden Kit, der alle von Ihnen benötigten Puffer und Reagenzien und ein detailliertes Protokoll enthält. Oder Sie bestellen lediglich die pAG-MNase und die Spike-in-DNA, falls Sie dies bevorzugen.

Wie alle CST-Produkte sind auch unsere Produkte für die CUT&RUN-Assays betriebsintern streng validiert, um sicherzustellen, dass sie in Ihren Experimenten funktionieren und Daten erzeugen, denen Sie vertrauen können.

Katalog-Nr. Produkt
86652 CUT&RUN Assay Kit
40366 CUT&RUN pAG-MNase and Spike-in DNA
14209 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN)
88989 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix
56795 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®
47538 SimpleChiP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers)
29580 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers)
14654 12-Tube Magnetic Separation Rack
7017 6-Tube Magnetic Separation Rack

Quellenangaben

  1. Skene PJ, et al. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. (2018) Nat. Protoc 13(5), 1006-1019. Pubmed 29651053
  2. Meers MP, et al. Improved CUT&RUN chromatin profiling and analysis tools. (2019) BioRxiv 1, 569129. bioRxiv 569129
  3. Skene PJ, and Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. (2017) Elife 6, e21865. Pubmed 28079019
  4. Janssens DH, et al. Automated in situ chromatin profiling efficiently resolves cell types and gene regulatory programs. (2018) Epigenetics Chromatin 22(1), 74. Pubmed 30577869
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